Métodos de análisis para evaluar la calidad de los fitofármacos

 Doctora Noemí Waksman de Torres

Doctora Rosalba Ramírez-Durón

Departamento de Química Analítica, Facultad de Medicina / UANL

La eficacia de los productos herbales para el cuidado de la salud se sustenta cada vez más en bases científicas. En un artículo publicado en 2009, en esta misma revista (1), hicimos énfasis en la importancia de la fitoterapia científica o racional, la cual toma de la fitoterapia tradicional el uso de las plantas como guía para realizar profundos estudios sobre ellas, que lleven a determinar cuál o cuáles son los principios activos de las mismas, para, con ello, disponer de drogas vegetales o extractos que cumplan con los criterios de calidad, eficacia y seguridad que se exige para cualquier medicamento de patente.

RETOS DE LA FITOTERAPIA

Fitofármacos, suplementos dietéticos, nutracéuticos, medicamentos herbales, productos naturales para la salud, medicina tradicional china, drogas ayurvédicas, plantas medicinales, etcétera…, etcétera… es difícil hoy en día estar al tanto del nombre de todas las categorías que se incluyen en la fitoterapia. Sin duda, todos estos productos constituyen un gran mercado mundial, por lo que cuestiones como reglamentación, seguridad,  eficacia y  valor económico, son complejas y difíciles de resolver.

A diario, nuevos productos se introducen en el mercado, y se prohíbe la venta de otros. Sin duda, se trata de un mercado difícil y competitivo, en el que siempre está presente la presión por mantener bajos costos de producción y maximizar la ganancia económica de los fabricantes, y éstos son los factores que determinan mayormente la calidad de los productos.

La información que se presenta en anuncios publicitarios o en la etiqueta de los productos a menudo es escasa o nula, sin sentido o muy técnica. Una pregunta central a todos estos productos debería ser: ¿Cómo se define y garantiza la calidad? Aunque la pregunta parece bastante simple, la respuesta no es fácil de encontrar.

 

LA CALIDAD

Consideremos algunos aspectos: comencemos por los medicamentos sintéticos o de patente:

• Desde el punto de vista analítico, la calidad contempla dos aspectos. La parte cualitativa, que se refiere a establecer la identidad del material, y el lado cuantitativo, que se enfoca en medir la cantidad de una o varias sustancias determinadas.
• Desde el punto de vista económico, el cual generalmente está ligado a los productos sintéticos; la calidad se asocia principalmente con la pureza: “Cuanto más alta, mejor”.
• Para la industria farmacéutica, la seguridad es un tema primordial. Calidad=seguridad se basa en alta pureza y en la medición precisa de la cantidad del principio activo. Hoy en día, cualquier nuevo fármaco tiene una lista de todas las posibles impurezas y un certificado que acredita que están ausentes hasta un  0.05 por ciento.

 

QUÍMICA ANALÍTICA

¿Qué significa esto para la química analítica? En primer lugar, las herramientas de análisis deben ser no sólo muy exactas y precisas, sino también muy sensibles. También deben permitir separar el principio activo de todas las impurezas que puedan estar presentes, las cuales, además, deben ser identificadas y cuantificadas.

Ahora veamos los productos derivados de plantas medicinales… la situación es muy diferente:

• Durante cientos o miles de años, estos fármacos se han utilizado en la medicina tradicional, sin ningún  tipo de sustento analítico.
• Mientras que Europa y  China luchan para que la regulación de sus  productos herbales sea la misma que se aplica para los medicamentos sintéticos, muchos países, entre ellos México, han elegido tratar los productos herbales como suplementos dietéticos. Esto crea el grave problema de que un mismo producto herbal, recetado por un médico en un país con estrictas normas de regulación, se venda sin receta, en formulaciones y combinaciones diversas en otros países que no siguen ninguna regulación o control de calidad.

 

«Para apoyar el valor de las medicinas herbales con hechos científicos y que puedan competir exitosamente con los medicamentos sintéticos, se deben realizar estudios clínicos y una gran cantidad de trabajo analítico, y no sólo quedarse con la idea de que son una alternativa natural y sin riesgos»

Determinar la  calidad en un producto herbal no es fácil, consideremos algunas razones:

• El enfoque analítico debe considerar el importante hecho de que se trata de mezclas complejas de sustancias.

• La información sobre su composición es limitada, dada su complejidad.
• Es muy difícil describir cuantitativamente la calidad de una droga botánica, a menos que el extracto de la planta entera sea considerado como el componente activo. Las excepciones son algunos casos donde la eficacia puede estar directamente vinculada a un único compuesto o a una combinación de componentes activos.

 

Por lo anteriormente expuesto, difícilmente una sola estrategia analítica resolverá el problema de determinar la calidad de un producto herbal; por lo tanto, es necesario usar combinaciones de las mismas. Diferencias en volatilidad, polaridad, solubilidad y desempeño cromatográfico hacen que se requieran diversos métodos para analizar todos los metabolitos. Se han usado métodos basados en Infrarrojo (IR), Resonancia Magnética Nuclear (RMN), Cromatografía en Capa Fina (CCF), Cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de Diodos y acoplada a Espectrometría de masas (HPLC/DAD, HPLC/EM), Electroforesis capilar acoplada a Ultravioleta-Visible y a Espectrometría de masas (EC/UV, EC/EM), Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de masas (CG/EM).

Seleccionar el método más adecuado es un compromiso entre rapidez, selectividad y sensibilidad. Por ejemplo RMN es selectiva y rápida, pero poco sensible, mientras que CG/EM y HPLC/EM ofrecen buenas sensibilidades y selectividades, pero son más lentos.

¿Qué método analítico será el adecuado? Esta pregunta plantea una serie de desafíos que hay que afrontar:

1. El análisis de marcadores o componentes activos en una matriz compleja y algunas veces desconocida.

2. Los analitos blancos podrían ser polares o térmicamente lábiles.

3. La falta de sustancias químicas o materiales de referencia  certificados.

4. La selección adecuada del método de extracción y análisis.

5. La variación entre lote y lote en la composición de la planta obtenida.

A continuación, se detallan los métodos más usados para los distintos objetivos del control de calidad de productos herbales.

 

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

La preparación de muestras es el paso más importante en el desarrollo de métodos analíticos para el análisis de productos herbales. Las operaciones básicas implican un prelavado, secado o liofilización del material molido, todo lo cual debe ser realizado de tal manera que se garantice la reproducibilidad de los resultados.

La extracción debe asegurar la integridad del material, para caracterizar correctamente los analitos endógenos y evitar encontrar metabolitos que sean artefactos producidos durante la extracción por reacciones de oxidación, hidrólisis o isomerización, entre otras. En algunos casos, se recomienda añadir antioxidantes al sistema de extracción. Dado que los extractos pueden tener una amplia gama de polaridades y pueden ser termolábiles, es necesario considerar y evaluar las ventajas de cada método de extracción según el caso en particular.

Para componentes volátiles, el método más utilizado es la hidrodestilación. Así se obtienen la mayor parte de los aceites esenciales de las plantas medicinales. Sin embargo, también se reporta el uso de head space (HS), método adecuado para el fraccionamiento de componentes volátiles de matrices complejas.

Sin embargo, la mayor parte de los analitos de interés medicinal en las plantas son de naturaleza no volátil, y son extraídos de diversas formas. En primer lugar, hay que considerar el solvente que se va a utilizar. Aunque la mayoría de las plantas medicinales se usan tradicionalmente como infusiones, la mayor parte de los extractos se obtienen con mezclas hidroalcohólicas. En las monografías de las farmacopeas herbolarias, se reportan diferentes solventes para la extracción de las plantas medicinales; sin embargo, nosotros encontramos, en un estudio con 20 plantas medicinales, que los extractos con mejor reproducibilidad y menor descomposición se obtuvieron con una solución hidroalcohólica, por lo que recomendamos su uso como primera opción (2).

Para el proceso de extracción, se mencionan en la literatura varios métodos, como son: soxhlet, sonicación, calentamiento a reflujo, maceración a temperatura ambiente y, más recientemente, la extracción asistida por microondas, extracción con fluidos supercríticos, extracción con fase sólida y microextracción con fase sólida.

 

LA EXTRACCIÓN

La extracción con Soxhlet ha sido la técnica más ampliamente usada y aún es considerada como la técnica estándar, con la cual se comparan las demás. Su ventaja es que es simple de realizar, es una extracción continua y tiene la posibilidad de extraer mayor masa que otros métodos de extracción. Sin embargo, los largos tiempos de extracción, altos consumos de solvente, posibilidad de descomposición de los analitos por la temperatura y falta de reproducibilidad la hacen menos útil como herramienta analítica que los otros métodos.

Aunque la sonicación es muy utilizada para la preparación de extractos con fines de control de calidad, hay que considerar que puede causar descomposición u oxidación de compuestos, lo cual debe ser tomado en cuenta cuando se desarrolla el método de extracción.

La extracción asistida por microondas usa la energía de las microondas para calentar la solución y reduce significativamente la temperatura y tiempo de extracción respecto de los métodos convencionales, reduciendo también el consumo de solventes orgánicos, y por consecuencia el problema de la disposición de los residuos. Existe la modalidad de extracción a presión atmosférica y altas presiones.

La extracción con fluidos supercríticos usa CO₂ a temperaturas y presiones por arriba de su punto crítico con algún modificador para extraer los compuestos presentes en plantas medicinales. Tiene alta especificidad y puede ser automatizada, pero el desarrollo y optimización de los métodos es muy laborioso.

La extracción con fluidos presurizados se usa comúnmente para el análisis de contaminantes orgánicos persistentes en muestras ambientales, pero también ha sido usada con éxito para la extracción de plantas medicinales, reduciendo tiempos y consumo de solventes. Esta técnica usa solventes orgánicos a elevadas temperaturas (mayores de 200 °C) y presiones (mayores de 200 bar), lo cual acelera drásticamente el proceso de extracción.

La desventaja de estos tres últimos métodos en un protocolo de control de calidad es el alto costo del equipamiento.

La extracción en fase sólida (EFS) es una técnica simple basada en los principios de la cromatografía líquida, que permite simultáneamente el fraccionamiento y concentración de los analitos de interés. Una amplia variedad de fases y solventes permite la separación de los distintos grupos de compuestos, basados en sus interacciones fisicoquímicas.

La microextracción en fase sólida (MEFS) es una técnica de muestreo que usa poco o ningún solvente, mediante la cual los analitos se absorben directamente en una fibra de sílice fundida, recubierta por un material absorbente, que se ajusta en un tipo de jeringa y luego es desabsorbida mediante distintas técnicas. Dependiendo del análisis posterior, puede ser por head space (HS) o por medio de algún solvente.

En cualquiera de los casos es importante considerar que, una vez hecho el extracto, no debe pasar mucho tiempo para la realización del análisis, aun y cuando se almacenen a baja temperatura. Recientemente demostramos, por medio de un diseño de experimentos, que el tiempo de almacenaje es uno de los factores que más afectan la calidad biológica de un extracto obtenido a partir de plantas medicinales (3).

 

A continuación, se describen los principales métodos para llevar a cabo el control de calidad en productos herbales: cromatografía y espectroscopía.

 

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

CCF. La cromatografía plana es considerada la más simple de todas las técnicas cromatográficas. Si bien, hasta hace relativamente poco, la cromatografía plana era considerada una técnica cualitativa simple y rápida, pero limitada en el aspecto cuantitativo frente a otras técnicas cromatográficas, como HPLC, el desarrollo tecnológico ha hecho renacer el interés por la cromatografía plana, particularmente la cromatografía en capa fina (CCF), actualmente considerada una técnica útil para separar y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas.

Estos avances han llevado al surgimiento de la denominada cromatografía en capa fina de alta resolución, (CCFAR o HPTLC en inglés). En HPTLC se utilizan placas de alta eficiencia, que originan desarrollos cromatográficos con zonas más definidas, mejor resolución y una detección más sensible.

Para la obtención de resultados óptimos, es fundamental el uso de sistemas de aplicación de la muestra semi o totalmente automatizados. La aplicación puede ser en punto o preferentemente en banda. La documentación del cromatograma se realiza bajo luz UV a 254 nm, 366 nm y luz blanca, antes y después de la derivatización, usando preferentemente sistemas de documentación por video o imágenes digitales, las cuales pueden ser editadas, almacenadas y usadas como referencia para análisis posteriores, o bien realizar el análisis densitométrico para llevar a cabo la cuantificación de sustancias marcadoras bien identificadas en el cromatograma.

En lo referente al análisis de productos herbales, la CCF y la HPTLC están incluidas en diversas farmacopeas, entre ellas la mexicana (FEUM), y en todas ellas son recomendadas para la evaluación cualitativa y cuantitativa de los componentes fitoquímicos de los productos herbales (4, 5). Eike Reich y Joseph Sherma (6), en su comentario editorial al volumen 93, No 5, de la AOAC (2010), dedicado al análisis de productos botánicos por medio de CCF, describen la cromatografía plana como la técnica ideal, por ser simple, rápida, económica y versátil. Además, señalan que las imágenes digitales del cromatograma y la información que contienen han abierto una nueva dimensión para el análisis cualitativo: la conveniente comparación de múltiples muestras respecto a similitudes y diferencias.

VALIDACIÓN EN  CROMATOGRAFÍA PLANA

La validación en sí es un proceso mediante el cual se demuestra la aplicabilidad y confiabilidad de un método analítico; consiste en la evidencia documentada que demuestra con alto grado de probabilidad que el método es lo suficientemente fiable.

 

La validación en CCF o HPTLC no debe verse como algo separado del desarrollo del método, sino que debe considerarse el proceso completo como aparece en la Tabla 1, empezando por una meta analítica bien definida, pasando por la selección, optimización o desarrollo del método según el caso, y tomando en cuenta consideraciones de prevalidación antes de comenzar con el protocolo de validación.

Luego de realizar todos los procedimientos establecidos en el protocolo de validación, se comparan los datos con los criterios preestablecidos de aceptación. Si se cumplen todos los criterios, entonces el método se considera como válido. Los requisitos de validación son altamente diversos, dependiendo del tipo de análisis. De acuerdo con las directrices internacionales, los métodos de cromatografía plana deben ser validados con respecto a la selectividad; sin embargo, los datos relativos a la reproducibilidad y robustez son también necesarios.

Tabla 1. Proceso de Validación

Método Validado

Robustez

Precisión

Especificidad

Protocolo de validación

Estabilidad

Optimización

Selección del método

Meta Analítica

 

HPLC

Es incuestionable que la HPLC es la técnica instrumental más empleada para el control de calidad, análisis y aislamiento de productos naturales bioactivos. Las ventajas de la cromatografía de líquidos incluyen su alta reproducibilidad, amplio rango lineal, fácil automatización y capacidad para analizar una gran diversidad de compuestos, tanto volátiles como no volátiles. Los modernos equipos permiten analizar de forma automática una gran cantidad de muestras, almacenar y procesar datos.

 La sensibilidad de la técnica depende del sistema de detección empleado. El uso de los acoplamientos con otros detectores, tales como EM, o los detectores evaporativos de dispersión de luz (ELSD), o la combinación de algunos de ellos (DAD-EM o DAD- ELSD) se ha incrementado en la última década.

VALIDACIÓN EN HPLC

La primera etapa en el desarrollo de cualquier método analítico es definir las características de las muestras (qué analitos se desea analizar, si se cuenta con estándares de referencia, en qué matriz se hará el análisis, qué rangos de concentración se espera encontrar), así como el propósito del análisis: si se requiere sólo información cualitativa o es necesaria la cuantificación de los analitos, o ambas.

Una serie de guías regulatorias para validación de métodos analíticos han sido propuestas para ser usadas por laboratorios de control de calidad para asegurar la identidad, pureza, potencialidad y eficiencia de medicamentos. En particular, la AOAC ha emitido una guía para la validación de métodos químicos empleados para el análisis de suplementos alimentarios y productos herbales (7). Las etapas del proceso de validación deben considerar desde el muestreo, la preparación de las muestras, la identificación o confirmación de los analitos, el protocolo de análisis que incluye la optimización y la aplicabilidad del método de acuerdo al propósito del mismo.

La optimización del método incluye parámetros como la eficiencia de la extracción, la resolución, el tiempo de análisis y la sensibilidad. Previamente al desarrollo y optimización de un método, es importante asegurar la funcionalidad del instrumento analítico, realizando la validación del equipo, determinando la precisión del flujo, volumen de inyección, temperatura, composición del solventes, etcétera). Los parámetros para la validación dependen de las características del método, el propósito del mismo y su aplicabilidad.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

En general, los siguientes parámetros de validación deben ser considerados: especificidad o selectividad, linealidad, exactitud, precisión, límites de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ) y  robustez.

CG. La Cromatografía de Gases (CG) ha sido empleada en el análisis de compuestos volátiles de los productos herbales con propósitos de establecer perfiles de identificación de las plantas, ya que la composición y concentración relativa de los compuestos orgánicos volátiles (aceites) son características de algunas plantas. Cambios en la composición de los aceites volátiles pueden indicar adulteraciones o indicar cambios enzimáticos, de oxidación o fermentación. La CG es altamente sensible para la detección de la mayoría de los componentes volátiles de un extracto. El empleo de los acoplamientos CG–EM proporciona, además, información de identidad de los compuestos.

La principal desventaja de la GC es que no puede ser empleada para análisis de compuestos polares y no volátiles, a menos que se realice una derivatización previa de la muestra. En los últimos años, se ha mejorado el desempeño de esta técnica con el uso de procedimientos de extracción alternativos a la hidrodestilación, por ejemplo la MEFS ya comentada anteriormente.

 

MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS

UV-Vis. Antes del desarrollo de la técnicas cromatográficas, una gran parte del control de calidad de los productos herbales se llevaba a cabo por medio de la espectroscopia Ultravioleta-Visible; a pesar de su sensibilidad, la falta de especificidad ha motivado que se haya dejado de lado, para dar paso al uso de otros métodos más específicos. Sin embargo, en muchas farmacopeas aún se presentan algunos casos de la valoración directa del extracto por medio de la espectroscopia UV-Vis. Por ejemplo, en la FEUM describe la valoración de contenido de los derivados hidroxiantracenónicos de Aloe vera, por medio de una lectura espectrofotométrica de los extractos a 512 nm (5).

RMN

Aunque la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es altamente recomendada para las elucidaciones estructurales, es hasta años recientes que la RMN cuantitativa ha atraído el esfuerzo de los científicos.

Hay pocas referencias de su uso para cuantificación directa en extractos herbáceos. Posiblemente por su costo no resulta competitivo frente a los métodos cromatográficos.

Se han reportado algunos métodos para analizar los componentes del Gingko biloba por medio de ¹HRMN. Esta planta, por la complejidad de sus componentes bioactivos, las trilactonas terpénicas por un lado y los flavonoides complejos por el otro, ha sido una de los blancos para estudios por RMN.

 

IR. Actualmente, la espectroscopia Infrarroja cercana (NIR), basada en los sobretonos y bandas de combinación de las señales vibracionales del IR cercano, ha sido empleada con buenos resultados para el análisis de huellas dactilares de productos herbales. Las ventajas que presenta esta técnica sobre las tradicionales técnicas cromatográficas son que no requiere tratamiento previo de la muestra, es un método no destructivo, puede ser usado tanto con propósitos cualitativos como cuantitativos y los tiempos de análisis son muy cortos.

Diversas técnicas quimiométricas se han empleado para el procesamiento de las señales espectrales; por ejemplo, métodos de calibración multivariable (PCA, PLS, PCR y MPLS). Aun así, la aplicación de la espectroscopia IR para el análisis de productos herbales es aún limitada.

REFERENCIAS

1. Waksman de Torres, Noemí, Conocimiento, 6, febrero 2009, 17-23
2. Ceniceros, L. Tesis de Maestría en Ciencias, UANL; 2006.
3. Pérez, L.; Orozco, H.; Rivas, V.; Waksman, N. Natural Products Communications, 2008, 3, 363-368.
4. Ankli, A.; Widmer, V.; Reich, E., in: Thin layer chromatography in phytochemistry, Vol 99, Waksmundzka, M., Sherma, J., Kowalska T. Ed., CRC Press, 2008, 37-57.
5. Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM) Comisión Permanente. Ed., Secretaría de Salud. 2001
6. Reich, E.; Sherma, J., J. of AOAC Int. 2010, Vol 93, 5, 1347-1348.
7. http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA417.pdf (consultada en Febrero de 2011)