Biólogo Genaro García Villafaña
Jefe del laboratorio Centro de Fertilidad IECH
ggarcíav67@hotmail.com
La finalidad de la fecundación in vitro (FIV) y el cultivo embrionario es conseguir embriones de buena calidad, capaces de desarrollar e implantar, lo que da lugar a nacimientos viables. Parte importante del éxito de esta técnica está sensiblemente comprometida por las condiciones subóptimas de cultivo, que pueden afectar el desarrollo embrionario normal y traer una disminución o pérdida de la viabilidad embrionaria. Desde los comienzos de estas técnicas, hasta hoy día, se han logrado avances considerables. A principios de los setenta se diseñaron y definieron nuevos medios de cultivo más complejos, basados en la composición de las secreciones del tracto genital (figura 1, desarrollo embrionario in vivo).
En los últimos 15 años, este esfuerzo inicial ha dado como resultado el desarrollo de medios de cultivo más fisiológicos, efectivos y capaces de mantener la viabilidad de los embriones desarrollados en el laboratorio de fertilización asistida.
Transcurridos más de treinta años del nacimiento del primer bebé de fertilización in vitro, la tasa de embarazos obtenidos con las diversas técnicas de reproducción asistida ha presentado un incremento progresivo. Actualmente, los reportes de la Sociedad Americana de Medicina Reproductiva (ARSM) y de la Sociedad Europea, (ESHRE) indican una tasa de gestación por ciclo transferido de entre un 30 y un 40 por ciento para fertilización in vitro (FIV) e inyección intracitoplasmática (ICSI), y alcanzan alrededor del 50 por ciento cuando las pacientes realizan un programa de donación ovocitaria (figura 2, FIV, figura 3 ICSI).
Los factores que intervienen en el aumento de las tasas de embarazo son:
- Mejor calidad embrionaria.
- Control de calidad del laboratorio.
- Mejoramiento de los esquemas de hiperestimulación ovárica controlada.
- Técnica de transferencia embrionaria y receptividad uterina.
Debemos disponer de sistemas de cultivo que permitan un desarrollo hasta el estadio de blastocisto. En la actualidad, se utilizan cocultivo y medios de cultivo secuenciales (figura 4, sistema de cultivo).
COCULTIVO
Como su nombre lo indica, el cocultivo es una técnica que consiste en mantener en el mismo sistema de cultivo a los embriones y alguna otra célula somática, que generalmente actúa como nodriza, al absorber las toxinas del medio, y proporciona nutrientes a los embriones, lo que permite un mejor desarrollo.
El cocultivo es un sistema complejo que trata de asemejar las condiciones in vivo, al ofrecer un mejor equilibrio que los medios simples. La técnica de cocultivo difiere completamente de las de cultivo embrionario clásicas. La elección de medio para el cocultivo embrionario es esencial: debe satisfacer las necesidades, tanto del embrión como de las células, lo que evidentemente no ocurre con todos los medios de cultivo. Los medios TCM199, CCM20 Y ISM2 son adecuados para cocultivo.
Existen varios aspectos importantes de la acción de las células en los sistemas de cocultivo:
- La interacción con las rutas metabólicas del embrión; por ejemplo, el déficit enzimático o de RNAm.
- El aporte de aminoácidos por parte de las células, lo que mejora el equilibrio y ayuda a una absorción eficiente, ofrece un equilibrio redox favorable (equilibrio entre sustancias oxidantes y reductoras a favor de éstas).
- Las sustancias reductoras, como glutatión e hipotaurina, que han demostrado ser muy eficientes para mejorar el desarrollo preimplantatorio.
- El catabolismo de los aminoácidos, que puede ser tóxico, debido a la formación de iones de amonio en condiciones de cultivo in vitro; el amoníaco forma carbonato o bicarbonato amónico, o ambos, que son muy inestables, sobre todo en PH básico. El amoníaco se elimina o se recicla enzimáticamente in vivo y en cultivo, mediante la formación de alanina, glutamina y aspargina.
MEDIOS DE CULTIVO SECUENCIALES
Durante mucho tiempo, el problema de las unidades de FIV fue no contar con medios de cultivo que pudieran obtener blastocistos viables. Por ejemplo, a principios de los noventa, se podía utilizar el medio Earl’s suplementado con suero de la paciente, y se obtenían blastocistos con una buena tasa de formación (40 por ciento) y apariencia morfológica; en contraste, las tasas de embarazo e implantación que se alcanzaban eran muy bajas (siete por ciento).
Las dos razones principales para la incapacidad de los medios para soportar el crecimiento de blastocistos viables era la ausencia de reguladores muy importantes del desarrollo embrionario, como los aminoácidos, y tener un solo medio para todo el desarrollo de los embriones en el periodo preimplantatorio, ignorando los cambios que se dan en el ambiente del tracto genital (oviducto y útero) femenino durante este periodo. Tomando en cuenta estos dos factores y otros, se han desarrollado los medios secuenciales que permiten obtener blastocistos viables; de esta manera, se han podido obtener altas tasas de embarazo e implantación.
Los embriones in vitro están expuestos a constantes cambios que se desarrollan en su paso a lo largo del oviducto al útero. Asimismo, los embriones, durante el desarrollo, manifiestan diferencias en cuanto a los requerimientos de los nutrientes, lo que refleja los posibles cambios metabólicos energéticos que ocurren entre la fecundación y el estadio de blastocisto.
Además de la necesidad de obtener espermatozoides fecundantes y óvulos fecundables, otro de los problemas que enfrentan los laboratorios de FIV es la obtención de embriones viables; esto se ve comprometido por las condiciones subóptimas de los medios de cultivo. Éste es un campo en continuo avance, de modo que la información continuará cambiando, debido al impresionante número de estudios que actualmente se realizan.
ENTORNO FISIOLÓGICO DEL EMBRIÓN
La composición de los medios de cultivo varía considerablemente, pero todos tienen dos objetivos; intentar conseguir bases funcionales que imiten con mayor exactitud el entorno fisiológico del embrión, y ajustarse a los requerimientos nutricionales durante su desarrollo preimplantatorio.
El entorno del embrión se encuentra enriquecido con piruvato, lactato y bajas concentraciones de glucosa, en las primeras etapas del desarrollo embrionario. Cuando el embrión alcanza el estadio de seis a ocho células, en ese momento el entorno baja sus concentraciones de lactato y piruvato, aumentando las concentraciones de glucosa. Además de las fuentes energéticas mencionadas en los medios de cultivo, otras sustancias colaboran en el metabolismo embrionario, tales como los aminoácidos, sales minerales, factores de crecimiento, vitaminas, enzimas.
Los ovocitos y embriones tienen sistemas de transporte específicos para los aminoácidos, lo que permite que sean metabolizados rápidamente; la glicina, el ácido glutámico, la taurina ayudan a regular el pH intracelular del embrión, cuyo mantenimiento es fundamental para minimizar el estrés homeostático y metabólico, responsable de la pérdida de la viabilidad embrionaria.
COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS
Los carbohidratos, junto con los aminoácidos, constituyen el principal sustrato energético para el embrión. Su concentración varía tanto en el fluido tubárico como en el uterino y a lo largo del ciclo menstrual. Los embriones in vivo están expuestos a diferentes gradientes de concentración de carbohidratos durante su desarrollo. En estadios tempranos de división, el sustrato energético utilizado por el embrión es el piruvato, en sinergia con el lactato; después de la compactación, ocurre un cambio “switch” con el incremento significativo en la utilización de glucosa.
Las sales minerales o iones contribuyen, en el medio de cultivo, a mantener la presión osmótica y a reducir el estrés osmótico. En el oviducto presentan altas concentraciones de potasio y cloruro. El calcio es esencial para que el embrión pueda llevar a cabo la compactación. Éstas son necesarias en cada una de las etapas del desarrollo embrionario.
El EDTA es un quelante de iones de metales pesados; se asocia con efectos benéficos sobre el desarrollo de embriones en división temprana, antes de la compactación de día 1 a día 3. (D+1 a D+3).
Tampón, amortiguador de pH o sistema buffer: el medio de cultivo debe mantener un pH dentro de los niveles fisiológicos de 7.2 a 7.4, lo cual se ha logrado principalmente con el sistema CO2/ bicarbonato (logra reproducir las condiciones de buffer fisiológico del fluido que rodea las células de mamífero) y HEPES. El pH debe mantenerse estable durante todo el periodo de cultivo y evitar daños irreversibles a los embriones.
ANTIBIÓTICOS
El uso de los antibióticos es controversial. En este aspecto, dependerá en gran medida de los criterios que cada centro emplee. Se postula que pueden servir como barrera contra patógenos al lavar los gametos en medio de cultivo con antibióticos antes de cultivarlos; sin embargo, también se han observado ciertos efectos dañinos en el desarrollo embrionario.
PROTEÍNAS
El uso de macromoléculas incorporadas en el medio de cultivo mediante la suplementación con suero sintético sustituto (SSS) o albúmina humana (HSA) favorece el desarrollo embrionario en todos los estadios de desarrollo durante el cultivo in vitro. A su vez, incorpora.
AMINOÁCIDOS
Los fluidos tubáricos y uterinos contienen cantidades significativas de aminoácidos (aa) libres, como alanina, aspartato, glutamina, glicina, serina y taurina, que varían en concentración a través de un gradiente formado desde la trompa hasta el útero. Se requieren aa no esenciales en estadio de división temprana (< de 8 células) y aa esenciales en estadio de post compactación (> de 8 células).
VITAMINAS
Las vitaminas están presentes en la formulación de medios complejos, tanto embriones de humano como de ratón. Aun cuando se conoce que las vitaminas del grupo B son parte integral del metabolismo de aa y carbohidratos, es necesario realizar más estudios que establezcan su importancia y si es necesario o no incluirlas en los medios de cultivo. Hasta el momento, la formación de blastocistos.
Habitualmente, las transferencias embrionarias a la cavidad uterina se realizan en un día, dos, tres o cinco; es decir, en estadios de desarrollo embrionario comprendido entre cuatro, ocho células o blastocisto. El bloqueo de división embrionaria lleva implícita la activación genómica. Por la simplicidad en el manejo parece ser que el futuro del cultivo embrionario reside en los medios secuenciales, ya que con su utilización se han conseguido tasas de desarrollo de blastocisto de alrededor del 65 por ciento.
DESRROLLO EMBRIONARIO
El proceso de fertilización consta de: penetración del espermatozoide, activación del óvulo, expulsión del segundo cuerpo polar, descondensación del espermatozoide, formación de los pronúcleos, singamia. Transcurridas entre 18 y 20 horas de la inseminación y el ICSI, se pueden apreciar los signos que indican que ha habido la fertilización; si el proceso de fertilización es correcto, se distinguen claramente dos pronúcleos, uno femenino y otro masculino, en el citoplasma del óvulo. En el interior de cada pronúcleo se distinguen de uno a nueve nucléolos. La extrusión del segundo cuerpo polar sucede tras la penetración del óvulo por un espermatozoide, completándose así el proceso de la meiosis en el ovocito.
El fallo de la fertilización se debe a la mala calidad de los ovocitos, citoplasma atrésico, bajo número de ovocitos, estadio de maduración, activación, factor masculino, reacción acrosómica, anomalías en la descondensación del esperma y condiciones sub-óptimas de cultivo.
CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA
En la evaluación de los cigotos y los embriones, se incuban a 37°C, 5 por ciento de CO2 y 99 por ciento de humedad. Los embriones se dividen cada 12 a 14 horas aproximadamente; así, a las 48 horas post captura, los embriones pueden encontrarse en estadios de crecimiento que van de dos a ocho células. Entre las 72 y 96 horas, los embriones pasan de 8 a 16 células, y se inicia la compactación. El estadio de blastocisto se alcanza aproximadamente a las 120 horas.
DESARROLLO EMBRIONARIO
El primer día, los cigotos son clasificados de acuerdo al número y alineación de los nucléolos; el día 2 a un día 3, los embriones son clasificados de acuerdo al número y tamaño de los blastómeros, división sincrónica o asincrónica, multinucleación, fragmentación y velocidad de división.
Es importante tener en cuenta que la calidad de los embriones está relacionada con las tasas de embarazo, así como también la edad, los antecedentes de la paciente, los esquemas de hiperestimulación y la receptividad endometrial.
TRANSFERENCIA
En cuanto a la transferencia, normalmente se transfieren de dos a tres embriones por paciente, pero esto depende de la edad y el tipo de infertilidad de la paciente, así como del desarrollo y la calidad de los embriones. Desde el momento en que se pudieron transferir blastocistos viables de manera rutinaria, se estableció el debate de qué día es mejor para transferir embriones (día 3 o 5). Varios estudios muestran una mejoría en cuanto a los resultados y se inclinan por la transferencia selectiva de un embrión para evitar el riego de embarazo múltiple.
CONCLUSIÓN
Gracias a todo el trabajo y la evolución de las técnicas de reproducción asistida que se ha logrado en todo el mundo, hoy en día contamos con una mejor tecnología, debido en parte a que disponemos de mejores laboratorios y equipo, así como de medios de cultivo y sistemas que permiten el desarrollo embrionario adecuado y ofrecer resultados óptimos a las pacientes que presentan algún tipo de infertilidad
