La Bella Durmiente, un cuento de hadas hecho realidad en la Biología Molecular.

Spread the love

Dr. Antonio Alí Pérez Maya

Profesor Investigador del Laboratorio de Genómica y Bioinformática.

Departamento de Bioquímica y Medicina Molecular.

Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

Aparte de su impacto en la organización y la evolución del genoma, los elementos transponibles pueden servir como valiosas herramientas para los análisis genéticos. En vertebrados, el descubrimiento de los DNA-transposones (elementos móviles que se mueven vía un intermedio de DNA) es relativamente reciente. Desde entonces, han aislado a los miembros de transposones eucarióticos de Tc1/mariner así como a los de las superfamilias hAT (hobo/Ac/Tam) a partir de diversas especies de peces, de Xenopus, y de genomas humanos.

Los miembros de la superfamilia de los transposones Tc1/mariner aislados de peces parecen ser transposicionalmente inactivos debido a la acumulación de mutaciones. Los datos filogenéticos moleculares fueron utilizados para construir un transposón sintético, Sleeping Beauty, que podría ser idéntico o equivalente a un elemento antiguo que se dispersó en los genomas de los peces en parte por la transmisión horizontal entre especies. Para lograr este propósito (Figura 1) una secuencia consenso de un gen de la transposasa de la subfamilia de los salmónidos fue modificada por mutagénesis dirigida eliminándose las mutaciones que mantenían inactivo a este gen.

Figura 1. Reconstrucción Molecular de un Gen parecido al de la Transposasa Salmónida (A) mapa esquemático de un TcE salmónido con los dominios conservados en la transposasa y las secuencias IR/DR flanqueantes. (B) se ilustra la estrategia de construir inicialmente un marco de lectura abierto para una transposasa salmónida y luego la introducción sistemática de reemplazos de aminoácidos en este gen. — Figura 1. Reconstrucción Molecular de un Gen parecido al de la Transposasa Salmónida
(A) mapa esquemático de un TcE salmónido con los dominios conservados en la transposasa y las secuencias IR/DR flanqueantes.
(B) se ilustra la estrategia de construir inicialmente un marco de lectura abierto para una transposasa salmónida y luego la introducción sistemática de reemplazos de aminoácidos en este gen.

El transposón SB (Sleeping Beauty), “rescatado” en 1997 en estado inactivo del genoma del salmón, se ha perfeccionado para utilizarlo como herramienta en mutagénesis insercional, “gene trapping” y en transferencia de DNA, no sólo en peces, sino en otras especies animales (como en las células del ratón y del ser humano). El transposón SB actúa por un mecanismo de “corte y empalme” del DNA, proceso catalizado por una transposasa. Cuando el DNA del transgen se flanquea con las regiones IR del transposón SB, la integración ocurre generalmente en una copia única y con el transgen íntegro, lo que representa una gran ventaja respecto a otros métodos de transferencia de DNA.

Los transposones Sleeping Beauty (SB) representan un tipo de elemento móvil que pertenece a la clase Tc1/mariner-type de transposones. Los transposones del tipo Tc1/mariner-type comprende casi el 3 % de genoma humano y por lo tanto es una clase minoritaria de transposones en el humano y otros genomas de vertebrados.

Los ADN transposones se mueven por un simple mecanismo de cortar y pegar (Figura 2) en el cual un segmento de ADN es escindido de una molécula de ADN y movido a otro sitio en la misma molécula de ADN o a otro en una molécula diferente.

Figura 2. Mecanismo de transposición de cortar y pegar para un ADN transposón con un gen de transposasa activo (Txp). Los transposones SB se integran sólo en bases apareadas TA. Después de la duplicación del sitio de TA durante la transposición, las secuencias TA son formadas en los extremos del transposón. Las flechas invertidas de color rojo, representando 230 bp cada una, son las únicas secuencias de ADN requeridas por la enzima transposasa para la transposición. Para la terapia génica, el gen de la transposasa es sustituido por una secuencia de ADN que codifica un producto terapéutico que podría ser proteína o una molécula de ARN.

La proteína que cataliza esta reacción, la transposasa, es codificada dentro del transposón en el caso de un elemento autónomo o puede ser suministrada en trans por otra fuente en el caso de que se trate de un elemento no autónomo. Las transposasas Tc1/mariner-type requieren que el sitio de integración presente un dinucleotido TA, una secuencia que es duplicada durante el proceso de integración.

El sistema SB de transposón Tc1/mariner-type consiste en dos componentes: I) un transposón, formado por un gen de interés flanqueado por repeticiones invertidas IRs, mostradas como cabezas de flechas (IR-DR en la fig. 2), y II) una fuente de transposasa. Durante la transposición mediada por Sleeping Beauty, la transposasa SB reconoce los extremos IRs y escinde al transposón del ADN plasmidico, y lo inserta en otro sitio de ADN. Este mecanismo se detalla en la figura 3.

Figura 3. Transposición mediada por SB de un sitio donante (líneas verdes) a un sitio de integración (líneas púrpuras). Dos moléculas de transposasa SB, se muestran como círculos amarillos en el caja insertada a la izquierda de la figura, unida a cada una de las repeticiones terminales invertidas (flechas) para introducir tres cortes, dos flanqueando al transposón (la estructura rosada con flechas invertidas que representan las repeticiones terminales invertidas) y un corte en el sitio de integración diana. El cuadro insertado enfatiza que las moléculas de transposasa SB actúan de forma coordinada en un complejo formado entre el transposón donante y el sitio de integración diana. El paso de escisión es mostrado seguido de la integración que ocurre por la invasión de los extremos 3' del transposón uniéndose a los nucleótidos TA expuestos en el sitio de integración (mostrado en los elipsoides). Después de la ligazón de las simples cadenas a cada lado, las enzimas de reparación del ADN rellenan los gaps restantes de 5 nucleótidos (mostrado en rojo). La duplicación de sitio de TA-diana es indicada al final por el cuadro de dinucleótidos de bases TA apareadas. La secuencia del transposón donante es resellada y los errores de apareamiento de base simple son reparados por enzimas celulares. — Figura 3. Transposición mediada por SB de un sitio donante (líneas verdes) a un sitio de integración (líneas púrpuras). Dos moléculas de transposasa SB, se muestran como círculos amarillos en el caja insertada a la izquierda de la figura, unida a cada una de las repeticiones terminales invertidas (flechas) para introducir tres cortes, dos flanqueando al transposón (la estructura rosada con flechas invertidas que representan las repeticiones terminales invertidas) y un corte en el sitio de integración diana. El cuadro insertado enfatiza que las moléculas de transposasa SB actúan de forma coordinada en un complejo formado entre el transposón donante y el sitio de integración diana. El paso de escisión es mostrado seguido de la integración que ocurre por la invasión de los extremos 3′ del transposón uniéndose a los nucleótidos TA expuestos en el sitio de integración (mostrado en los elipsoides). Después de la ligazón de las simples cadenas a cada lado, las enzimas de reparación del ADN rellenan los gaps restantes de 5 nucleótidos (mostrado en rojo). La duplicación de sitio de TA-diana es indicada al final por el cuadro de dinucleótidos de bases TA apareadas. La secuencia del transposón donante es resellada y los errores de apareamiento de base simple son reparados por enzimas celulares.

La estructura de transposón mostrada en la Fig. 2 es representativa de la clase de transposones autónomos, que es un transposón que codifica una transposasa activa que dirige el proceso de transposición. Hasta el momento, no ha sido encontrado ningún gen activo Tc1/mariner-type o parecido al de la transposasa SB en los genomas de los vertebrados, aunque miles de genes de la transposasa sumamente mutados hayan sido encontrados en proyectos de secuenciación de genomas. Por consiguiente, todos los 20,000 transposones Tc1/mariner-type que residen en el genoma humano son estables. En contraste, algunos retroelementos son activos y ocasionalmente saltan en humanos.

Como ha sido notado antes, los transposones Tc1/mariner se han encontrado prácticamente en cada genoma animal en el que han sido buscados, aunque en general en la mayoría de los animales y en particular en vertebrados sus genes de la transposasa parecen ser defectuosos. El sistema de transposón SB fue construido basado en principios filogenéticos, en un proceso de 10 pasos de mutagénesis sitio específica de un gen de la transposasa salmónida que hace más de 10 millones de años se había inactivado durante la evolución. La Transposasa que había sido despertada fue llamada La Bella durmiente (Sleeping Beauty).

El transposón T más la transposasa SB comprenden el sistema de transposón SB. Para la terapia génica (figura 4), ambos componentes del sistema SB son entregados a las células en plásmidos, el transposón y el gen de la transposasa, que cuando es expresado puede cortar al transposón del plásmido portador para su nueva inserción en un cromosoma. El gen de la transposase SB puede estar o no en el mismo plásmido portador que el transposón.

Figura 4. Estructura de Sleeping Beauty y su manipulación para ser usado en terapia génica.

Como se muestra en la figura 5, la transposasa SB original es capaz de mejorar la integración en células cultivadas de mamíferos de 20 a de 40 veces y alrededor de 20 veces en embriones de zebrafish. En una competencia cara a cara, se mostró que la tasa de transposición mediada por el sistema de transposón SB era casi un orden de magnitud más alto que aquellos observados para una variedad de transposones de nematodos y moscas en células humanas cultivadas (HeLa).

En todos estos experimentos fueron usados transposones no autónomos, por ejemplo, transposones en los cuales el gene de la transposasa fue sustituido por una carga genética alternativa (Figs. 4 y 5). La transposasa generalmente era suministrada por otro plásmido que llevaba el gen de la transposasa o por un mRNA que codificaba para dicha enzima.

Figura 5. Uso de transposones SB para terapia génica.

REFERENCIAS

1. Converse, A., Belur, L., Gori, J., Liu, G., Amaya, F., Aguilar-Cordova, E., Hackett, P. B. & McIvor, R. S. (2004). Counterselection and co-delivery of transposon and transposase functions for Sleeping Beauty-mediated transposition in cultured mammalian cells. Bioscience Reports, Vol. 24, No. 6, 577-594.

2. Zsuzsanna Izsva´k and Zolta´n Ivics. Sleeping Beauty Transposition: Biology and Applications for Molecular Therapy . Molecular Therapy Vol. 9, No. 2, 147-156, February 2004

3. Perry B. Hackett, Stephen C. Ekker, David A. Largaespada and R. Scott McIvor. Sleeping Beauty Transposon-Mediated Gene Therapy for Prolonged Expression. Non-Viral Vectors for Gene Therapy, 2nd Edition. Leaf Huang, Ernest Wagner and MienChie Hung, eds. 2004

4. Zolta´n Ivics, Perry B. Hackett, Ronald H. Plasterk, and Zsuzsanna Izsva. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell, Vol. 91, 501–510, November 14, 1997, Copyright 1997 by Cell Press

5. Gallardo, J.B., Méndez, T., Porta, J., Álvarez, M.C. y Béjar, J. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. Puesta a Punto del Sistema de Transposición SB (Sleeping Beauty) en las Líneas Celulares de Peces SAF-1 y TV-1. http://nevada.ual.es/agr-176/pdfs/BMA05.pdf. Fecha de consulta: 17 de Marzo de 2006.

6. J. Brian Lam. Awakening Sleeping Beauty: A study of insertional sites using Bioinformatics. http://gator.lite.cise.ufl.edu:8070/courses/Bioinformatics/studentpre/brian03.ppt. Fecha de consulta: 17 de Marzo de 2006.

La Bella Durmiente, un cuento de hadas hecho realidad en la Biología Molecular.